CÁC PHƯƠNG PHÁP PHÂN LẬP – NUÔI CẤY VI SINH VẬT
A. Phân lập vi sinh vật
Trong tự nhiên hoặc các mẫu bệnh phẩm, vi sinh vật thường tồn tại ở dạng hỗn hợp gồm nhiều loài khác nhau và gây ra nhiều bệnh với các triệu chứng khác nhau trên nhiều đối tượng sống (thực vật, động vật và con người). Để hiểu rõ về trạng thái hình thái, sinh lý, lý hóa hoặc cách thức gây bệnh và tương tác với chủ thế sống, việc phân lập và đưa chúng về dạng thuần khiết đơn lẻ là điều cần thiết để định danh và kiểm soát tác nhân gây bệnh.
Nguyên tắc: Phân lập vi sinh vật là quá trình tách rời các loài vi sinh vật từ quần thể ban đầu và đưa về dạng thuần khiết, tạo thành các tế bào khuẩn lạc riêng rẽ, cách biệt nhau.
1. Kỹ thuật hộp ria:
- Dùng que cấy vòng thao tác vô trùng thu giống.
- Ria các đường trên đĩa petri chứa môi trường thích hợp. Sau mỗi đường ria, đốt khử trùng đầu que cấy và làm nguội trước khi thực hiện đường ria tiếp theo.
- Bao gói đĩa petri, ủ ở nhiệt độ và thời gian thích hợp trong tủ ấm.
Mua dụng cụ ria mẫu và đĩa petri uy tín, chất lượng tại đây>>>
2. Kỹ thuật trải đĩa:
- Dùng micropipet và đầu tips vô trùng, thao tác vô trùng chuyển 100uL dịch nuôi cấy lên bề mặt môi trường nuôi cấy trong đĩa petri.
- Nhúng đầu que trang thủy tinh vào cồn 96 độ, đốt trên ngọn lửa đèn cồn để khử trùng và để nguội.
- Trải đều dịch giống bằng que trang lên bề mặt thạch một cách nhẹ nhàng, trong khi trải thực hiện xoay đĩa một vài lần để trải dịch giống đều khắp môi trường.
- Bao gói đĩa petri, ủ ở nhiệt độ và thời gian thích hợp trong tủ ấm.
3. Kỹ thuật đổ đĩa:
- Dùng micropipet và đầu tips vô trùng, thao tác vô trùng chuyển 100uL dịch chứa giống vi sinh vật vào 20 – 25 mL môi trường đã tiệt trùng và để nguội đến 45 – 55 độ C, lắc đều và sau đó tiến hành đổ vào đĩa petri.
- Xoay nhẹ đĩa petri để dàn đều môi trường trong đĩa.
- Đậy nắp đĩa, để đông tự nhiên, sau đó ủ ở nhiệt độ và thời gian thích hợp.
B. Nuôi cấy vi sinh vật
Nuôi cấy vi sinh vật là phương pháp làm tăng mật số vi sinh, làm cho đối tượng vi sinh cần sử dụng và thử nghiệm phát triển nhanh trên các môi trường chuyên biệt để tạo ra những đặc trưng riêng của loại vi khuẩn đó.
Quy tắc quan trọng trong nuôi cấy vi sinh vật phải đảm bảo tuyệt đối vô trùng bao gồm quá trình thao tác trong tủ cấy, dụng cụ cấy, dụng cụ nuôi cấy, … tránh tạp nhiễm từ không khí và môi trường bên ngoài.
1. Phương pháp cấy chuyền và bảo quản giống
Cấy giống từ môi trường lỏng sang ống nghiệm lỏng/đĩa thạch/ống thạch nghiêng:
- Đốt nóng đỏ đầu que cấy trong ngọn lửa đèn cồn.
- Tay trái cầm ống nghiệm chứa vi sinh vật xoay nhẹ, tay phải cầm que cấy và ngón út tay phải dùng để mở nút bông → Hơ miệng ống nghiệm qua ngọn lửa đèn cồn.
- Đưa que cấy đã khử trùng vào bên trong ống nghiệm, nhúng vào môi trường lỏng chứa vi sinh vật để thu sinh khối, rút thẳng que cấy ra, hơ nóng miệng ống và đậy nút bông.
- Đầu que cấy chứa vi sinh vật chuyển vào ống nghiệm chứa môi trường lỏng mới, cấy ria lên đĩa thạch hoặc ống thạch nghiêng.
- Khử trùng que cấy sau khi cấy xong.
Bảo quản giống:
- Giống được bảo quản trong môi trường thạch nghiêng ở 4 độ C với thời gian bảo quản tối đa là 3 tháng.
- Giống được bảo quản trong glycerol dạng lỏng ở – 20 độ C có thể nâng thời gian bảo quản tối đa lên đến 10 năm.
Tham khảo thêm các dụng cụ cần thiết cho quá trình phân lập vi sinh vật tại đây>>>
2. Một số môi trường nuôi cấy vi sinh vật
- Môi trường xác định (defined medium): thành phần hóa học của các chất được xác định chính xác.
- Môi trường bán tổng hợp (complex medium): chứa chiết xuất nấm men, thịt hay thực vật; peptone (sản phẩm thủy phân của protein); vitamin và các yếu tố sinh trưởng …
- Môi trường chọn lọc (selective medium): hạn chế sự phát triển của vi khuẩn không mong muốn và làm tăng sự phát triển của vi khuẩn mong muốn (VD: Bismuth sulfite agar sẽ ức chế vi khuẩn gram (+) và hầu hết vi khuẩn gram (-) trong đường ruột, ngoại trừ Salmonella typhi).
- Môi trường chuyên biệt (differential medium): giúp phân biệt khuẩn lạc của vi khuẩn mong muốn (Blood agar: Streptococcus pyogenes).
- Môi trường tăng sinh (enrichment medium): tăng nồng độ vi khuẩn mong muốn (môi trường chứa phenol để phân lập vi khuẩn có khả năng sử dụng phenol từ mẫu đất).
Tài liệu tham khảo:
- Thí nghiệm vi sinh vật học BÀI 2 : CÁC PHƯƠNG PHÁP PHÂN LẬP VI SINH VẬT. Nguồn: https://www.academia.edu/
- https://www.tmcc.edu/microbiology-resource-center/lab-protocols/bacterial-isolation
- https://bio.libretexts.org/Learning_Objects/Laboratory_Experiments/Microbiology_Labs/Microbiology_Labs_II/Lab_03%3A_Obtaining_Pure_Cultures_from_a_Mixed_Population
- https://repository.seafdec.org.ph/bitstream/handle/10862/1616/Chapter1-Bacterial-Isolation-Identification-and-Storage.pdf;jsessionid=213A756A8DA0837F4F1DE74C49A52881?sequence=1